文献解读低起始量ONT测序,组装两种传疟

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昆虫是地球上数量最多的动物群体，它们种类繁多形态各异，大到身长可达17cm的泰坦甲虫，小到肉眼所观不知何处的寄生蜂，且每类昆虫的不同群体呈现出惊人的遗传多样性。它们遍布世界各地，有的为维持生态系统功能和满足人类需求勤勤恳恳、默默付出，有的严重危害农业生产和人类健康。按蚊是传播疾病危害公共卫生的祸首之一，在分子水平上加深该物种基因组功能和遗传多样性的理解对控制疟疾至关重要。但由于它们个体小，使得高质量的基因组组装困难重重。

近日，《GigaScience》在线发表了一篇题为《Chromosome-levelgenomeassembliesofthemalariavectorsAnophelescoluzziiandAnophelesarabiensis》的文章，研究者们使用1μg来自同系交配的按蚊DNA进行ONT测序，结合Hi-C技术，获得了科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊的全新高质量染色体水平的参考基因组，为促进深入研究非洲疟疾主要媒介的生物学和遗传学功能打下了基础，同时详细描述了一套可为其它病媒基因组组装提供参考的组装流程。

那么问题来了，如何从如此小个体的微量DNA中获得如此高质量的基因组呢?下面请和组学君一起探索小型昆虫的基因组组装攻略吧！

研究材料科鲁兹按蚊：A.coluzziiMOPTI(Acol-MOP1)；阿拉伯按蚊：A.arabiensisDONGOLA(AaraD3）技术平台OxfordNanopore、Hi-C研究背景

按蚊是传播疟疾的专属病媒，又称疟蚊，对全球公共卫生具有毁灭性的影响，其中科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊是撒哈拉以南非洲最普遍的重要传播媒介，可在长效杀虫剂使用的区域出没，表现出明显的抗药性；与按蚊媒介能力相关的性状是由遗传决定的，比如雌性阿拉伯按蚊在进食时对宿主表现出的选择性行为就是受到与染色体倒位2Rb和3Ra相关的等位基因的影响。按蚊具有丰富的遗传多样性，且不同的按蚊种类之间存在基因渗入，这为研究如何通过种间遗传交换获得增强病媒能力的性状提供了契机。对于同域但是在地理位置、幼虫生态、交配行为以及旱季时的生存策略等方面有所差异的按蚊群体，基因组分析研究完全可以推断出它们是如何决定和维持这些不同的适应机制的。另外，某些按蚊种类的基因组呈现高度多态性，仅仅只有草图基因组，将会面临许多基因注释的问题：如基因整个缺失，或存在丢失的外显子或gap，亦或者被scaffold分开，这使得预估总基因数量或基因拷贝数非常困难，而这些未被发现的基因很有可能就是关联到重要表型性状的基因。高质量的基因组组装可以准确发现按蚊隐群，为正在进行的按蚊生态学和杀虫剂抗药性进化的基因组研究清除障碍。

研究策略与方法材料选择与测序Nanopore测序分别以科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊为研究材料，从经过6代近亲繁殖的同胞雄性个体中分离基因组DNA用于OxfordNanopore测序，以降低杂合性，各分离出了约1μgDNA用于测序。测序分别获得28G和35G数据，N50分别为19Kb和21Kb，与近缘物种冈比亚（AgamP4）按蚊基因组进行比对计算测序覆盖度分别为x和x。阿拉伯按蚊Hi-C文库使用材料为雌雄同比例的生长1～2天的未成熟个体，共构建两个文库，按蚊个体数分别为20只和60只，测序最终获得17.8Gb和27.7GbIllumina双端测序数据；科鲁兹按蚊的3个生物学重复Hi-C数据来源于之前的研究。组装方法策略

OxfordNanopore长reads用于后续contig组装，使用Illumina短reads对组装的contig进行polish，Hi-C数据用于辅助将contig组装到染色体水平，与以前发表的组装版本比较评估新组装基因组的完整性和连续性，同时在新的参考基因组中为固定和多态型染色体倒位的断点提供基因组坐标。组装流程见下图。

图组装流程与策略

主要研究结果基因组组装结果与评估本研究通过OxfordNanopore和Hi-C测序技术结合的方法，分别使用1μg总DNA量为起始对两种按蚊进行测序，优化比较了不同组装算法的组装结果，最终综合获得了科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊染色体级别的组装基因组，组装大小分别为.4Mb和.8Mb（Table3）；每个组装基因组均包含3个染色体级别的scaffolds（X，2，3）、完整的线粒体及无序的contigs组成，这些contigs被鉴定为常染色体着丝粒周围DNA、X着丝粒周围DNA和Y序列，BUSCO评估分别为99.7%和99.2%。

将科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊的测序数据比对到近缘物种冈比亚按蚊的基因组时，科鲁兹按蚊和阿拉伯按蚊比对率分别为99%和89%，未比对率分别为1%和11%。分析了Ag53C串联重复的存在，组装结果显示科鲁兹按蚊A.coluzziiMOPTI(AcolMOP1)存在最高的Ag53C串联重复（），阿拉伯按蚊A.arabiensis(AaraD3)组装基因组包含重复次数的和A.gambiae(AgamP4)相当，而A.coluzziiNgousso(AcolN1)组装仅仅包含41个重复拷贝。值得

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