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从基础研究到抗疟药物开发杨茂君组连续发文
BioArt按：近日，清华大学生命科学学院杨茂君教授联合中科大微尺度物质科学国家实验室田长麟、郑晓研究组在PhysicalChemistryChemicalPhysics杂志发表题为《通过温控电子自旋共振以及量子计算研究酵母Ndi1反铁磁式电子传递机理》的研究文章，揭示了酵母呼吸链II型复合物INDH-2（Ndi1）催化电子传递的具体机制，并发现Ndi1中电子传递通路间存在反铁磁量子行为，打破了以前认为只可能存在于金属材料中的反铁磁现象，彻底阐明了这类蛋白中的电子如何在电子轨道中进行精确传递的机制（下图）。
在另一篇由杨茂君教授联合清华药学院饶燏研究组和中科院巴斯德所江陆斌实验室在JournalofMedicinalChemistry杂志发表题为《通过结合小分子的恶性疟原虫PfNDH2晶体结构获得药物靶点以治疗抗药性疟疾》的研究文章中，首次解析并报道了全新抗恶性疟疾药物靶点呼吸链II型复合物I（PfNDH2）与药物分子复合物的高分辨率的晶体结构，在蛋白结构和生化水平上解释了这种药物分子抑制恶性疟原虫线粒体呼吸链工作的机制，并且在疟原虫繁殖和小鼠体内证明了此药物分子的高效抗疟效果。
论文解读：
呼吸作用是生物体基本生命活动之一。哺乳动物中，呼吸作用依靠线粒体中的呼吸链大分子蛋白质机器来完成，包括复合物I（NADH脱氧酶）、复合物II（琥珀酸脱氧酶）、复合物III（细胞色素c还原酶）、复合物IV（细胞色素c氧化酶）以及复合物V（ATP合成酶）。年杨茂君教授研究组先后在Nature和Cell杂志率先报道了线粒体呼吸链超级复合物呼吸体的原子分辨率结构，并提出了全新的电子传递机理，为人类正确理解细胞氧化磷酸化过程提供了坚实的基础（详见BioArt此前的报道：清华杨茂君课题组Cell发表突破性研究成果）。
在部分低等真核生物（如酵母）以及原核生物中，不存在类似于哺乳动物中的复合物I，起替代作用的是II型复合物I，其电子传递通路明显不同于复合物I，并且由于其只存在于致病微生物而不存在于人体细胞中，因而被认为是天然的特异性药物靶点。年杨茂君教授研究组在Nature上率先报到了酵母来源的II型复合物I（Ndi1）的结构（下图），近期又连续发表论文，将量子力学研究手段在结构生物学领域中成功应用，揭示了Ndi1全新的电子传递机制，更为研发全新的治疗耐药性疟疾的药物提供了精确的结构信息。
酵母中的Ndi1蛋白能够以FAD为辅基催化电子从NADH传递给泛醌（UQ）。在此之前，杨茂君研究组解析了Ndi1的高分辨率晶体结构及Ndi1与NADH、UQ以及NADH-UQ三种底物复合物的晶体结构，并应用电子自旋共振（ElectronSpinResonance,ESR）方法揭示Ndi1中同时存在两个泛醌（UQI，UQII）结合位点（Nature，）。
经典线粒体复合物借助一系列铁硫簇（Fe-Scluster）间的反铁磁相互作用（antiferromagnetism,AFM）介导的“量子隧穿”效应完成电子传递，但Ndi1蛋白中并不含有铁硫簇，其电子传递机制研究具有特殊意义。应用变温ESR方法（K-2K）发现Ndi1蛋白中尽管缺失Fe-S簇，其电子传递过程中仍然存在着反铁磁现象(AFM)。通过针对不同Ndi1电子传递中间体的变温ESR谱图拟合分析获得了反平行电子自旋对之间的海森堡交换耦合常数J，结合量子化学计算方法，系统阐释了Ndi1蛋白中电子从NADH传递到泛醌的通路和机制。结果表明，在Ndi1蛋白电子传递过程中，FAD中间体自由基的b自旋与UQI半醌自由基的a自旋之间存在着自由基AFM相互作用，当UQI接受了从FADH2依次传来的两个电子，又将电子依次传递给UQII，在这一过程中，半醌自由基对(UQI-UQII)之间也存在着AFM量子行为。进一步的量化计算和生物功能数据表明，Ndi1催化的电子传递过程中的AFM效应是源于辅基p键堆积（p-stacking）间的through-space交换相互作用（下图）。这一研究结果不仅从机理上阐述了Ndi1中的具体电子传递机制，也为研究和应用生物分子的磁学性质提供了新的思路。
Ndi1电子传递机理
由于II型复合物I只存在于低等生物中，所以一直以来科学家都认为这一蛋白是一很好对抗病原菌的特异性靶标分子。目前疟疾在全世界范围内每年仍造成43万人的死亡和万新增病例。历史上针对传统抗疟疾药物的耐药虫株不断出现；研究人员8年在湄公河流域一些国家（柬埔寨、越南、缅甸等）就发现了对抗疟疾特效药青蒿素耐药的虫株，并且近些时间来有扩散趋势。因此，新的抗疟疾药物和抗疟疾机制是当前重要的研究内容。疟原虫II型复合物I（PfNDH2）是已知的抗疟疾靶点，但是由于其与抑制剂的作用机制并不清楚，导致经典的基于结构的药物设计缺乏有效信息，再加之现有抑制剂极差的类药性质，针对PfNDH2进行抗疟疾药物研发存在较大困难。
现有抑制剂溶解度极差，还导致其几乎不可能与靶蛋白共结晶，研究人员首先对已报道的化合物进行了大量的亲水性化学修饰发现了活性更好的化合物RYL-和RYL-S，并进一步总结了构效关系。阐明机制的过程中，RYL-作为理想的工具分子可以与靶蛋白共结晶，并得到了高分辨率的晶体结构（下图）。大量生物化学、生物物理学、分子生物学、药物化学构效关系研究等信息都表明RYL-通过别构调节对PfNDH2产生抑制作用。
RYL-与PfNDH2的结合方式
研究工作发现RYL-和RYL-S对九种从四大洲收集来的耐药疟原虫株都具有很好的抑制作用，且对人体细胞毒性较低；动物实验亦具有很好的治愈效果且与青蒿素有协同抗疟疾作用，因此具有与青蒿素联合用药发展新的疟疾治疗方法的潜能。此研究成果不仅提供了一种全新的可用于联合用药的抗疟药物分子，为有效地治疗耐药疟疾奠定了重要的基础，更开辟了一种利用II型复合物I作为药物靶点的全新的研究思路。
中科大吴凯棋、清华大学生科院李文斐和中科院合肥研究所于璐为第一篇文章的共同第一作者，清华大学生命科学学院杨茂君教授、中国科技大学生命科学学院微尺度物质科学国家实验室田长麟教授和郑晓教授为本文共同通讯作者；清华大学药学院杨毅庆、生命学院于游和中国协和医科大学李小璐为第二篇文章的共同第一作者，清华大学生命科学学院杨茂君教授、药学院饶燏研究员和中国科学院上海巴斯德研究所江陆斌研究员为本文共同通讯作者。本工作获得清华大学结构生物学高精尖中心、清华-北大生命联合中心、清华大学自主科研基金、清华大学蛋白质科学教育部重点实验室、科技部重大科学研究计划专项、国家杰出青年基金和国家自然科学基金的大力支持。
（致谢：感谢杨茂君教授为BioArt提供的信息和支持！）
杨茂君教授简介杨茂君，年生于山东省泰安市；年毕业于吉林大学生命科学学院，并于3年于中国协和医科大学获博士学位师，后加入美国西南医学中心从事博士后研究。8年特聘为清华大学生命科学学院特别研究员、博士生导师；年受聘为清华-北大生命科学联合中心研究员；年通过tenuretrack系列考核，成为清华大学首批tenure系列终身教授，年获得国家杰出青年科学基金资助并成为“长江学者”特聘教授。回国以来，杨茂君教授一直致力于综合运用结构生物学、生化与分子生物学等方法，研究与人类健康密切相关的重大疾病的发病机理及特异性抑制剂的筛选与设计，在基于线粒体呼吸链复合体的电子传递机理、细胞感应外界信号以及物质跨膜转运、蛋白质翻译后修饰调控等领域取得了一系列重大研究成果，先后在Nature、Science、Cell、MoleculaCell、GenesDevelopment、PNAS和Cellresearch等国际权威期刊发表通讯作者论文多篇。此外，杨茂君教授曾获得多项荣誉与奖励，包括霍英东基础研究奖励、教育部新世纪优秀人才支持计划、茅以升北京青年科技奖、药明康德生命化学研究奖、谈家桢生命科学创新奖等。
